纳米技术能够以近原子分辨率可视化RNA结构

我们生活在一个由RNA制造和运行的世界，RNA是基因分子DNA的同等重要的兄弟姐妹。事实上，进化生物学家假设RNA甚至在DNA及其编码的蛋白质出现之前就存在并自我复制。快进到现代人类：科学表明，不到3%的人类基因组被转录成信使RNA(mRNA)分子，而信使RNA(mRNA)分子又被翻译成蛋白质。相比之下，其中82%被转录成具有其他功能的RNA分子，其中许多仍然是神秘的。

要了解单个RNA分子的作用，需要在其组成原子和分子键的水平上破译其3D结构。研究人员经常研究DNA和蛋白质分子，方法是将它们变成规则堆积的晶体，可以用X射线束(X射线晶体学)或无线电波(核磁共振)检查。然而，这些技术不能以几乎相同的效率应用于RNA分子，因为它们的分子组成和结构灵活性阻止它们容易形成晶体。

现在，由WyssCore教员PengYin博士领导的一项研究合作。在哈佛大学Wyss仿生工程研究所和MaufuLiao博士。在哈佛医学院(HMS)，报告了一种全新的RNA分子结构研究方法。ROCK，顾名思义，使用RNA纳米技术，可以将多个相同的RNA分子组装成高度有序的结构，从而显着降低单个RNA分子的灵活性并使其分子量成倍增加。研究小组将具有不同大小和功能的著名模型RNA用作基准，表明他们的方法能够使用称为冷冻电子显微镜的技术对所含RNA亚基进行结构分析(冷冻电镜)。他们的进展发表在NatureMethods中。

“ROCK正在打破目前RNA结构研究的限制，并能够以近原子分辨率解​​锁现有方法难以或不可能访问的RNA分子的3D结构，”Yin说，他与Liao一起领导了这项研究.“我们预计这一进展将振兴基础研究和药物开发的许多领域，包括新兴的RNA治疗领域。”Yin还是Wyss研究所分子机器人计划的负责人，也是HMS系统生物学系的教授。

获得对RNA的控制

威斯研究所的尹教授团队开创了各种方法，使DNA和RNA分子能够根据不同的原理和要求自组装成大型结构，包括DNA砖和DNA折纸。他们假设这种策略也可用于将天然存在的RNA分子组装成高度有序的环状复合物，通过将它们特异性连接在一起，它们的弯曲和移动自由度受到高度限制。许多RNA以复杂但可预测的方式折叠，小片段彼此碱基配对。结果通常是稳定的“核心”和“茎环”向外围凸出。

“在我们的方法中，我们安装了‘接吻环’，将属于相同RNA的两个拷贝的不同外周茎环连接起来，从而形成一个整体稳定的环，包含多个感兴趣的RNA拷贝，”Di说刘博士，两位第一作者之一，尹氏课题组博士后。“我们推测这些高阶环可以通过cryo-EM进行高分辨率分析，该技术已首次成功应用于RNA分子。”

描绘稳定的RNA

在低温EM中，许多单个粒子在低温下被快速冷冻以防止任何进一步的运动，然后通过电子显微镜和计算算法的帮助进行可视化，这些算法比较粒子的2D表面投影的各个方面并重建其3D结构.Peng和Liu与Liao和他的前研究生FrançoisThélot博士合作，后者是该研究的另一位共同第一作者。Liao和他的团队为快速发展的低温电磁场以及特定蛋白质形成的单个粒子的实验和计算分析做出了重要贡献。

“与传统方法相比，Cryo-EM在查看包括蛋白质、DNA和RNA在内的生物分子的高分辨率细节方面具有很大优势，但大多数RNA的小尺寸和移动趋势阻碍了RNA结构的成功确定。我们组装RNA多聚体的新方法通过增加RNA的大小并减少其运动，同时解决了这两个问题，”同时也是HMS细胞生物学副教授的廖说。“我们的方法为通过冷冻电镜快速测定许多RNA的结构打开了大门。”RNA纳米技术和cryo-EM方法的整合使该团队将他们的方法命名为“通过安装接吻环实现RNA寡聚化的cryo-EM”(ROCK)。

为了为ROCK提供原理验证，该团队专注于来自单细胞生物四膜虫的大内含子RNA和来自固氮细菌Azoarcus的小内含子RNA，以及所谓的FMN核糖开关.内含子RNA是散布在新转录的RNA序列中的非编码RNA序列，必须“剪接”出来才能生成成熟的RNA。FMN核糖开关存在于与维生素B2衍生的黄素代谢物生物合成有关的细菌RNA中。在结合其中一种黄素单核苷酸(FMN)后，它会转换其3D构象并抑制其母RNA的合成。

“将四膜虫I组内含子组装成环状结构使样品更加均匀，并能够利用组装结构的对称性使用计算工具。虽然我们的数据集规模相对适中，但ROCK的先天优势使我们能够以前所未有的分辨率解决结构问题，”Thélot说。“RNA的核心分辨率为2.85Å[1Ångström是100亿(US)米，是结构生物学家使用的首选度量标准]，揭示了核苷酸碱基和糖骨架的详细特征。我不认为我们没有ROCK就可以到达那里——或者至少在没有更多资源的情况下不会。”

Cryo-EM还能够捕获处于不同状态的分子，例如，如果它们改变其3D构象作为其功能的一部分。将ROCK应用于Azoarcus内含子RNA和FMN核糖开关，该团队设法识别了Azoarcus内含子在其自剪接过程中转变的不同构象，并揭示了FMN核糖开关配体结合位点的相对构象刚性.

“彭寅和他的合作者的这项研究优雅地展示了RNA纳米技术如何作为促进其他学科发展的加速器。能够可视化和理解许多天然存在的RNA分子的结构可能会对我们对许多生物学和病理学的理解产生巨大影响跨不同细胞类型、组织和生物体的过程，甚至可以实现新的药物开发方法，”Wyss创始董事DonaldIngber医学博士说。