萤火虫荧光素酶报告基因（报告基因）

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1、（1）最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因，通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况。

2、（2）氯霉素乙酰基转移酶（CAT）：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA）检测其活性，也可进行蛋白质印迹（Westernblotting）和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。

3、（3）β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷（ONPG）为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷（FDG）为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学（FACS）分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

4、（4）荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素（coelenterazine）氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。

5、荧光素酶报告基因有许多优点：①非放射性；②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10—16mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol/L的荧光素酶。Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产生的光稳定。

6、（5）分泌型碱性磷酸酶（SEAP）：SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐（PNPP）为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D—荧光素—O—磷酸盐水解生成D—荧光素，后者又可作为荧光素酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性。

7、（6）荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP）是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母（AequoreaVictoria）中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体（red—shiftmutant），其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白（BFP）、增强型GFP(EGFP）和去稳定EGFP(destabilizedEGFP）等。红色荧光蛋白（RFP）是从珊瑚（Discosoma sp．）中分离的发光蛋白（drFP583或DsRed），可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。

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